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今天推送的文章是2023年4月发表在Angew.Chem.Int.Ed.上的“Engineering the Substrate Specificity of a P450 Dimerase Enables the Collective Biosynthesis of Heterodimeric Tryptophan-Containing Diketopiperazines”，通讯作者是上海交通大学的瞿旭东教授与孔旭东长聘教轨副教授。

具有非对称二聚化框架(HTDKPs)的二酮哌嗪类化合物(DKPs)是一类具有多样化生物活性的重要天然产物(图1)。HTDKPs具有多环和密集功能化的骨架，因此很难通过化学方法获得其复杂的结构，可以通过P450介导的DKPs二聚化来生物合成。近年来，在各种HTDKPs的生物合成过程中，发现了一系列具有不同区域特异性和立体特异性的P450二聚酶同源物。通过自由基级联反应形成具有区域特异性和立体特异性的分子内和分子间碳-碳键，并基于大肠杆菌和耻垢分枝杆菌的全细胞生物催化，成功地利用不同的DKP底物合成了40种类似物。

作者之前的研究阐明了p450在控制二聚化的不同区域和立体特异性方面的保守调控机制，从而允许对底物进行精确催化。通过结合DKP底物的变化和反应的区域特异性和立体特异性，有望获得HTDKPs的结构多样性和相关的生物活性。二聚酶可接受的底物范围有限。HTDKP二聚酶有两个结合口袋，分别容纳DKP的上、下部分。下方底物结合口袋相对灵活，可以接受一系列环状底物，包括cWLAL、cWLPL、cWLVL、cWLIL、cWLLL、cWLML、cWLFL、cWLYL和cWLWL，而上方底物结合口袋则相对受限。只有三个DKP(cWLPL，cWLAL，cWLVL)底物可以被已鉴定的二聚酶NasS1868(ASPB)，NasbB(NASB)，NascB和Nas_F5053(NzeB)所催化，而在最近鉴定的天然HTDKP tetratryptomycin b中发现了一个cWLWL (图1)。此外，HTDKP二聚酶对DKP色氨酸基团中取代基的修饰表现出较差的耐受性。具有代表性的HTDKPs是由二聚反应产生的。被上方和下方结合口袋接受的DKP底物分别显示为红色和黑色。

为了充分发挥这些有价值的反应在合成HTDKPs中的潜力，需要阐明和扩展P450二聚酶的底物特异性，特别是对上方DKP部分和色氨酸基团的底物特异性。作者利用基因组挖掘和蛋白质工程来扩大P450二聚酶反应的底物专一性。使用工程化P450 Nas_F5053，成功地实现了HTDKPs的集约生物合成，极大地扩大了它们的结构多样性。

作者首先比较了P450二聚酶的上方底物结合口袋序列，以确定不同底物专一性的关键残基。然而，在以前的工作中发现的所有P450(NascB，NasbB，Nas_F5053和Nas_S1868)都具有高度的同源性和相同的对小型底物选择性。因此进行了序列同源性搜索，以确定可能具有不同底物特异性的P450二聚酶。在本研究中作者从Actinomadura oligospora中鉴定出一个P450，命名为NAS_AO，它与NascB的同源性只有50%，远远低于之前鉴定的其他同源序列。

在分枝杆菌异源表达系统中成功地表达和纯化了NAS_AO。通过体外筛选其对不同cWLXL底物的活性，在FDX和FdxR以及NADPH循环系统的存在下，作者发现NAS_AO可以催化两个cWLFL分子的自二聚化产生NAS-40(图2)。此外，NAS_AO还可以将其与cWLWL二聚化生成NAS-41，其中cWLFL被上方结合口袋接受(图2)。

最近，Li等人报道了一种P450 TtpB2，它可以催化两种cWLWL底物的C3-N1‘二聚反应合成四霉素(图1)。尽管TtpB2的催化机制明显不同于其他形成HTDKP的P450，但TtpB2仍显示出与NascB 40%的同源性，这表明它可能具有类似于上方底物口袋的底物专一性。

为了确定NAS_AO和TtpB2的这种差异，作者将NAS_AO和TtpB2与另外三个只能接受cWLPL、cWLAL和cWLVL的P450 (NascB、NasbB和Nas_F5053)进行了比较。序列比对表明，上方口袋中的两个残基387和388在两组P450之间在大小上有明显不同(图3A)。接受小底物的三个P450在该位置(F387-F388)都有较大的苯丙氨酸，而NAS_AO和TtpB2中对应的残基分别为较小氨基酸（A387-F388和V387-I388）。此外，Nas_F5053晶体结构中的这些苯丙氨酸残基通过构成上方口袋而接近DKP底物，这可能会对较大的底物造成空间位阻(图3B)。因此，结合序列比对和晶体结构分析的结果，推测残基387和388在底物选择性中起关键作用。

为了验证这一假设，针对P450 Nas_F5053和NAS_AO上的387和388位突变构建了三个突变体。对于Nas_F5053，将这两个残基与NAS_AO和TtpB2相应的氨基酸交换，分别得到了Nas_F5053-F387A和Nas_F5053-F387V-F388I。同样，将NasF5053中387位的苯丙氨酸引入到NAS_AO中构建了NAS_AO-A387F。结果显示，Nas_F5053-F388A显示出对cWLFL的活性，并产生了两种二聚化产物NAS-40和NAS-42(图2)。此外，Nasao-A388F失去了原有的催化活性，不能接受cWLFL作为其底物。这些结果清楚地证实了F387是限制上方结合口袋中底物结合的关键因素。与Nas_F5053-F387A相比，通过将TtpB2残基替换到Nas_F5053(Nas_F5053-F387V-F388I)中产生的突变体不能接受cWLFL和cWLWL作为底物，这可能是由于它们结合袋中的微环境不同所致。

接下来使用之前化学合成的28种环二肽底物来评估Nas_F5053-F387A突变体的底物特异性，然而，该突变体只接受cWLFL进行二聚化。为了探索其他突变体的作用，对Nas_F5053中的残基F387和F388分别进行饱和突变。突变体Nas_F5053-F387G可以接受两个新的DKP cWLLL和cWLIL作为底物，产生了两个cWLLL衍生物NAS-43和NAS-44和一个cWLIL衍生物NAS-45(图2)。

更重要的是，作者发现Nas_F5053-F388N可以接受7Cl-cWLPL进行二聚化并产生NAS-28(图2)。在天然产物中引入卤素原子是通过各种偶联反应创造结构多样性的重要途径。考虑到氟对提高分子的代谢稳定性和生物活性很重要，作者开始探索所产生的突变体接受含氟环二肽底物的可能性。以含氟的色氨酸为原料，合成了4种5/6/7/8F-cWLPL底物。然而，通过Nas_F5053-F388X和Nas_F5053-F387X的突变文库进行筛选，都没有发现有活性的突变。通过分析Nas_F5053上方底物结合口袋周围的残基，发现 E73位于αB‘-αC环上，与底物非常接近，可能会影响卤化底物进入活性口袋的方式。对该位置的饱和突变和对突变体活性的筛选使突变体E73S能够接受所有4氟取代的5/6/7/8F-cWLPL底物而产生6个新的自二聚产物，关键残基E73的成功鉴定对于利用取代的DKP扩大HTDKP的结构多样化提供了有效的途径。

通过对Phe387、Phe388和Glu73进行改造，作者成功地扩展了Nas_F5053上底物结合口袋的底物专一性，产生了12个二聚化产物。最后，通过将P450突变体转入至耻垢分枝杆菌，并交叉添加两种不同的环二肽底物，实现了该类天然产物的集约式生物合成，产生了至少93种以上新结构交叉二聚的吡咯并吲哚生物碱产物（表1），大大增加了HTDKPs的结构多样性。

为了更好地理解不同突变体表现出的新底物选择性的分子基础，作者解析了相关突变体的晶体结构，包括无底物F387G、上方口袋中有一个5FcWLPL的E73S、上方口袋中有两个6FcWLPL的E73S和上方口袋中有一个8F-cWLPL的E73S。通过比较apo-F387G与作者先前报道的野生型结构，以及E73S/6F-cWLPL与野生型Nas_F5053/cWLPL结构，发现总体蛋白质结构、血红素和底物的构象差异不大（RMSD值分别为0.20 ?和0.16 ? ）(图4A)。这些发现表明，所有的这些结构都有一个共同的起始构象。

为了获得更详细的信息，将两个cWLLL和两个cWLIL底物进一步分别对接到F387G结构的活性口袋中。与野生型Nas_F5053/cWLPL复合结构一致，F387G中的底物均呈U型构象。此外，它们的N1-H靠近血红素，N10和C2之间的距离在3.2 ?左右，这是N1处自由基的产生和迁移以及N10和C2之间的分子内Mannich反应形成吡咯吲哚C3自由基所必需的。通过分析上方底物的构象，作者发现相应DKP的L-亮氨酸和L-异亮氨酸部分都朝向F387G。将F387突变为小残基甘氨酸显著减少了口袋周围的空间位阻，从而使突变体能够识别大型底物cWLIL和cWLLL(图4B-4C)。

对于突变体E73S，通过其与6F-cWLPLs对接的结构进行了分子动力学(MD)模拟。由于E73位于αB‘-αC环上，因此主要关注突变对该loop区(残基从65到84)的影响。E73S中大部分残基的RMSF值较高，表明该区域比野生型更灵活。尤其是R71在空间上与E73非常接近，在所有loop残基中RMSF值差异最大(图4D)。为了更深入地了解这些变化，进行了底物通道分析，发现由于R71和E73的存在，野生型到上方底物结合口袋的底物隧道非常弯曲(图4E)。然而，在E73S突变体中检测到了位于S73和R71附近的新隧道(图4F)。作者推测这个新的通道可能有助于氟化底物的通过，它的产生归因于空间位阻的减少和R71位点在谷氨酸转化为丝氨酸后的灵活性增加。

总之，作者揭示了三个关键位点（F387、F388 和 E73）对 P450 二聚酶上方底物结合口袋中的底物特异性至关重要。结构和分子动力学分析表明，F387 和 E73 分别通过控制底物结合和进入口袋来决定底物特异性。对 Nas_F5053中的这些残基进行改造，可以接受八种其他底物 cWLFL、cWLIL、cWLLL、7Cl-cWLPL 和 5/6/7/8F-cWLPL，从而显著增加了 HTDKP 的数量和结构多样性。为进一步扩大HTDKPs和潜在的其他种类吡咯并吲哚生物碱的结构多样性提供了一种新的途径。

END

DOI：10.1002/anie.202304994